Nature | “生物快递”：利用细菌收缩注射系统进行蛋白递送
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内共生菌分泌效应因子调节宿主生理活动，对维持共生体的稳定具有重要意义1。由于许多效应因子并不能轻易地穿过细胞膜，细菌衍生出了一系列精密的递送系统来传递这些货物，收缩注射系统 (contractile injection systems, CISs) 就是其中之一。该系统作为类注射器样的纳米机器，与噬菌体的尾部极为相似2。
CIS是由可收缩的鞘包裹坚实的管状结构所组成的大分子复合物，其外部的鞘锚定在基板上，末端为刺突蛋白3。通常认为，CIS递送的货物会先被运输进管状结构的腔内，与管状结构或刺突本身融合，当CIS识别靶细胞后，货物蛋白将通过鞘收缩被注射到宿主细胞内4。
通常来说，CIS可以锚定在细菌细胞膜表面，形成接触依赖性的递送系统，如细菌的VI型分泌系统 (type VI secretion system, T6SS)3；也附着于蓝藻类囊体膜的表面 (tCIS)5，在细胞应激反应时被活化；此外，它们还能以游离形式 (eCIS) 存在，在不依赖于细菌的情况下进行货物递送6。此前研究发现，eCIS能够靶向小鼠细胞7，提示其具有递送治疗性蛋白药物的潜力。然而，eCIS是否能在人类细胞中发挥作用尚不清楚。
2023年3月29日，来自麻省理工的张锋团队在Nature上在线发表了一篇题为Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system，结合Alphafold结构预测，对eCIS进行了一系列工程化改造，使其能够特异性地靶向人类细胞，并向细胞内进行特定货物蛋白的高效递送，该系统的开发对于新型临床疗法的研发具有极大的意义。
在本文中，研究者选择了Photorhabdus (光杆状菌) 属的eCIS——PVC (Photorhabdus virulence cassette) 作为主要的研究对象。在PVC约20 kb的操纵子中，包含了16个核心基因 (pvc1-16)，其表达产物主要被用于注射系统的装配。表达PVC荷载货物的基因位于其下游，分别为Pdp1和Pnf，其产物能够通过PVC的鞘收缩和刺突-管复合物的分解进入靶细胞内 (图1)。
图1. PVC的结构及作用示意图
在将P.asymbioticaATCC 43949的PVC (PVCpnf) 分别克隆进不同的表达质粒 (pPVC用于表达结构蛋白和附属蛋白，pPayload用于表达货物蛋白和调节蛋白) 后，研究者利用工程化的E.coli对PVC进行了表达。在负染电镜下，可见蛋白复合物与经典的eCIS形态相似，具有完整的基板和鞘，整体长度约为116 nm (图2)。当纯化得到的PVC复合物与Sf9昆虫细胞接触时，PVC可以紧密地黏附于昆虫细胞表面 (图2)，证实E.coli能够被用来组装形成PVC复合物。此外，在尝试将外源的货物蛋白装配进入PVC的过程中，研究者发现内源货物蛋白N端一段高度无序的区域与装配过程存在密切的相关性，并将其称为包装结构域 (packaging domain)，只有具备该区域的蛋白才能被装配到PVC中。
图2. 利用E.coli重组表达PVC
当研究者使用PVC向Sf9细胞中递送其内源的毒素货物时，可以观察到Sf9细胞因毒素的作用迅速死亡，且该过程需要一些关键的PVC基因参与，包括pvc13 (编码PVC尾部纤维，可能作为靶向元件) 和pvc15 (可能作为货物装载蛋白存在) (图3,f)。此外，在携带loxP-GFP报告基因的Sf9细胞中，PVC递送的Cre可以诱导细胞出现明显的绿色荧光信号 (图3,g)，表明重组PVC对培养的昆虫细胞具有生物活性，并可以将非内源蛋白货物递送到靶细胞中。
图3. PVC能够高效地靶向昆虫细胞并发挥生物活性
虽然PVC与靶细胞结合的机制尚不完全清楚，但目前对噬菌体可收缩的尾部已有广泛的研究，而二者之间具备一定的相似性。许多研究表明，对噬菌体或其他亚型CIS的尾部纤维进行改造可以改变它们对靶细胞的特异性，并且这种改变是可以被人为预测的。基于这样的先验知识，研究者认为，或许也能通过同样的策略来改变PVC靶向细胞的特异性。
在后续的实验设计中，研究者选择了对PVC为尾部纤维蛋白Pvc13进行改造，以探究使PVC靶向人类细胞的可能性。Pvc13远端的尖部是被认为最先与细胞膜接触的部位，通过利用Alphafold对该部位的结构进行预测，发现当设定Pvc13为三聚体时，其C端会形成一个具备球形末端的螺旋管状结构 (图4)。在该区域插入能够特异性识别人类细胞的结构域 (如trimeric knob domain for human adenovirus 5或EGFR-DARPin E01) 后，发现组装形成的PVC均能结合并杀死人肺腺癌细胞A549，证实对Pvc13的改造可以产生可预测的靶向性的改变 (图4)。除此之外，研究者还尝试了将大小不同的外源货物蛋白 (如spCas9 (Streptococcuspyogenes Cas9)、ZFD (zinc finger deaminase) 以及毒素等) 装入编辑后的PVC中，发现PVC同样能传递这些货物，并在人类细胞中进行有效的基因编辑或针对性地杀死肿瘤细胞。
图4. 对PVC尾部Pvc13进行改造可以使其具备识别人类细胞的能力
为了进一步探究PVC对靶细胞的特异性，研究者利用HEK 293FT细胞构建了一系列表达非内源受体的细胞系，这些受体主要由能够靶向各种商业化标签的scFv或纳米抗体组成，对应的商业化标签被插入PVC尾部纤维远端的结合结构域中，通过这样的策略，这些非内源受体能够很容易地被改造后的PVC识别。实验结果表明，改造后的PVC只会将货物递送到具有对应抗体的细胞中 (图5)，表明其递送的特异性主要通过尾部纤维与其靶向受体之间的相互作用实现。
随后，研究者进一步在内源受体上对PVC的靶向作用进行了验证。当PVC被赋予靶向EGFR的特性 (插入anti-EGFR DARPin (E01) 序列) 并装载Pdp1、Pnf毒素时，可以有效且特异地杀伤EGFR+的细胞系，进一步对该递送体系的特异性进行了佐证。
图5. 对PVC的改造可以赋予其识别靶细胞的特异性
在动物模型中，改造后的PVC可以通过靶向特定受体向小鼠细胞输送蛋白质，将Cre酶递送到小鼠的神经元中 (图6)，提示PVC在动物体内仍能发挥其生理活性。此外，研究者还发现PVC不会引起免疫反应或产生显著的细胞毒性。以上结果均表明，PVC在未来可能成为一种有效的基因或蛋白的递送工具，在临床治疗中发挥实际的用途。
图6. 在体条件下PVC能够发挥良好的生物活性
综上，本文的研究结果表明，鉴于PVC的可改造性、高效性和特异性，作为蛋白质递送的有效载体，对未来基因治疗和癌症治疗可能具有重要的临床应用价值。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-023-05870-7
参考文献
参考文献
1. Green, E. R. & Mecsas, J. Bacterial secretion systems—an overview. Microbiol. Spectr. 4, https://doi.org/10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-2015 (2016).
2. Taylor, N. M. I., van Raaij, M. J. & Leiman, P. G. Contractile injection systems of bacteriophages and related systems. Mol. Microbiol. 108, 6–15 (2018).
3. Böck, D. et al. In situ architecture, function, and evolution of a contractile injection system. Science 357, 713–717 (2017).
4. Wang, X. et al. Characterization of Photorhabdus virulence cassette as a causative agent in the emerging pathogen Photorhabdus asymbiotica. Sci. China Life Sci. 65, 618–630 (2022).
5. Weiss, G. L. et al. Structure of a thylakoid-anchored contractile injection system in multicellular cyanobacteria. Nat. Microbiol. 7, 386–396 (2022).
6. Chen, L. et al. Genome-wide identification and characterization of a superfamily of bacterial extracellular contractile injection systems. Cell Rep. 29, 511–521.e2 (2019).
7. Rocchi, I. et al. A bacterial phage tail-like structure kills eukaryotic cells by injecting a nuclease effector. Cell Rep. 28, 295–301.e4 (2019).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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